Calcein AM /PI試劑盒

貨號：C30002

存儲溫度：4℃避光干燥

產品簡介：

鈣黃綠素-AM (Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液，分別對活細胞和死細胞染色，可用于同時對活細胞和死細胞進行熒光染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯親脂性很高，使其可透過細胞膜。盡管Calcein-AM本身并不是熒光分子，但通過活細胞內的酯酶作用，Calcein-AM能脫去AM基，產生的Calcein能發出強綠色熒光(激發: 490 nm，發射: 515 nm)。因此Calcein-AM僅對活細胞染色。另一方面，作為核染色染料的PI不能穿過活細胞的細胞膜。它穿過死細胞膜的無序區域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產生紅色熒光 (激發: 535 nm，發射: 617 nm)。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。用545 nm激發，僅可觀察到死細胞。由于不同細胞系的最shi染色條件不同，我們建議個別確定Calcein-AM和PI的合適濃度。

試劑 

Calcein-AM 2mM 50uL in DMSO; PI (2mM) 150uL in water

用熒光顯微鏡觀察細胞形態

以HeLa細胞染色為例，請注意不同的細胞種類、不同濃度，有不同的觀察條件。根據細胞條件，摸索不同條件下的細胞貼壁情況和試劑濃度的配制等最shi條件。

1. 染色溶液的配制

1) 用1 ml無水DMSO溶解2 mg Calcein-AM，制備成2 mmol/l的Calcein-AM儲備液，-20℃下密閉冷凍保存。

2) 用1 ml ddH2O溶解2 mg PI，制備成2 mmol/l的PI儲備液，-20度下密閉冷凍保存，可以保存一年。

3) 將Calcein-AM儲備液和PI儲備液放置于室溫。

4) 加5 µl Calcein-AM儲備液和15 µl PI儲備液至5 ml PBS中配制成染色溶液。Calcein-AM的終濃度為2 µmol/l，PI的終濃度為4.5 µmol/l。

2. 細胞染色

1) 染色HeLa細胞等貼壁細胞時，先用Trypsin-EDTA等消化細胞，制備成細胞懸液。

2) 將細胞懸液離心3分鐘 (1,000 rpm)。

3) 去除上清液，加入PBS緩沖液，細胞數量調整至10e5-10e6個/ml。再用移液器充分混勻。

4) 由于培養基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水會分解，會導致空白上升，所以需要離心數次，用PBS洗滌數次直到*洗凈。

5) 將200 µl細胞懸液移至小試管中，加入100 µl染色溶液，在37℃下孵育15分鐘。

6) 在蓋玻片上滴加適量的染色的細胞溶液。

7) 在熒光顯微鏡下，先用490±10 nm波長激發，觀察黃綠色的活細胞，還可以同時觀察到紅色的死細胞，然后用545 nm波長激發，能夠看到紅色的死細胞。

3. 染色試劑的最shi濃度

   Calcein-AM和PI最shi濃度根據不同的細胞種類而定，通過以下的操作，我們可以找到不同細胞染色試劑的最shi濃度。

1) 通過在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黃皂苷中孵育10分鐘或通過在70%乙醇中孵育30分鐘制備死細胞。

2) 用0.1-10 µM PI溶液對死細胞染色，以便找到僅對細胞核染色而不對細胞質染色的PI濃度。

3) 用0.1-10 µM Calcein-AM溶液對死細胞染色，以便找到不對細胞質染色的Calcein-AM濃度。接著用該濃度的Calcein-AM對活細胞染色以檢驗活細胞可否被染色。

注意事項

1) Calcein-AM的ester部位遇到濕氣會分解，使用后請在-20度下密閉冷凍保存，防止水分進入。Calcein-AM儲備液用緩沖液或培養基等稀釋時盡量現配現用。

2) 使用時一定要帶手套、眼罩、口罩。萬一接觸到皮膚的話，迅速使用大量水清洗。

產品參數