羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(橙紅）

產(chǎn)品貨號(hào)：G0063

儲(chǔ)存條件：-20℃干燥、避光保存。配成溶液后建議分裝。

產(chǎn)品參數(shù)

Ex/Em：546/575 nm

產(chǎn)品簡介：

鬼筆環(huán)肽是從致命的傘形毒蕈蘑菇中分離出來的一種毒素。它是特異性結(jié)合于 F-肌動(dòng)蛋白的雙環(huán)肽。因此用熒光染料標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可以非常方便的研究 F-肌動(dòng)蛋白的分布。鬼筆環(huán)肽內(nèi)部，在半胱氨酸和色氨酸之間含有不常見的硫醚橋形成內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。在pH 升高時(shí)，該硫醚被裂解，鬼筆環(huán)肽失去對肌動(dòng)蛋白的親和力。

在各種植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞中，標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對大、小細(xì)絲具有相似的親和力，平均每個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基結(jié)合一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子。不同于抗體，鬼筆環(huán)肽與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合親和力在不同物種間沒有顯著變化。非特異性染色可以忽略不計(jì)，染色和未染色區(qū)域之間的對比度非常大。鬼筆環(huán)肽將單體/聚合物的平衡轉(zhuǎn)向聚合狀態(tài)，將聚合臨界濃度降低至 30 倍。Phallotoxins 可通過抑制細(xì)胞松弛素的解聚，碘化鉀和升高的溫度，穩(wěn)定 F-肌動(dòng)蛋白。因?yàn)楣砉P環(huán)肽綴合物很小， 大約直徑 12-15 埃，分子量<2000 道爾頓，多種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，包括肌球蛋白，原肌球蛋白和后肌鈣蛋白依然可以和鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白結(jié)合。更重要的是，鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲保持功能，標(biāo)記甘油肌纖維仍然收縮，標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲仍然可以繼續(xù)移動(dòng)。而且熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽也可用于對細(xì)胞中 F-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行定量研究。

使用方法

1、儲(chǔ)液制備

Rhodamine-Phalloidin：取適量甲醇或無菌水溶解棕色管中凍干的粉末，制備成 200T/mL 的儲(chǔ)液（300T 規(guī)格染料加入 1.5 mL 的液體，50T 規(guī)格染料加入 0.25 mL 的液體即可）。

Rhodamine-Phalloidin 的一個(gè)單位（T）的定義是染色一個(gè)加載細(xì)胞的載玻片所用染料的量。對于羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，使用時(shí)的推薦稀釋比例為 1: 40-1: 200，一個(gè)單位相當(dāng)于 200 μL 總?cè)旧w積中加入 1-5 μL 200T/mL 儲(chǔ)備溶液。注：稀釋比例可以根據(jù)實(shí)際染色效果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

2、固定細(xì)胞染色

以下方案是針對生長在玻璃蓋玻片或 8 孔室玻片上的貼壁細(xì)胞的染色步驟。鬼筆環(huán)肽也可用于染色固定的冷凍或石蠟組織切片。

（1）用PBS 清洗細(xì)胞 3 次。

（2）用含有 3.75%甲醛的 PBS 溶液固定細(xì)胞，冰上固定15 min。

注：甲醇可以在固定過程中破壞肌動(dòng)蛋白。因此最hao避免含有任何甲醇的固定劑。優(yōu)選的固定劑是不含甲醇的甲醛。

（3）用PBS 清洗細(xì)胞 3 次。

（4）用含 0.5% Triton X-100 的PBS 溶液在室溫下透化細(xì)胞10min。

（5）用PBS 清洗細(xì)胞 3 次。

（6）用 200 μL PBS 稀釋 1-5 μL 熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽儲(chǔ)液， 加入一個(gè)蓋玻片或孔中，室溫孵育 20 min，進(jìn)行染色。

注：染色體積可根據(jù)樣本情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。孵育過程中為避免染液揮發(fā)，可將蓋玻片放于密封容器內(nèi)。

（7）用 PBS 清洗細(xì)胞 2-3 次。

（8）熒光顯微鏡觀察。標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽具有很好的光穩(wěn)定，樣品可以在 PBS 中成像，但為了效guo最jia，也可以使用抗熒光淬滅劑觀察。

3、活細(xì)胞染色

熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽不具有細(xì)胞透性，因此沒有被廣泛用于活細(xì)胞標(biāo)記。然而，有報(bào)道稱活細(xì)胞可能通過胞飲或未知機(jī)制進(jìn)行標(biāo)記。一般來說，染色活細(xì)胞時(shí)需要更多的染料。或者，熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽也可被注入到細(xì)胞中用于監(jiān)測肌動(dòng)蛋白分布和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。

注意事項(xiàng)

本產(chǎn)品為凍干粉形式，微量不易觀察，使用前請瞬時(shí)離心，加適當(dāng)溶劑溶解后使用，溶解后的溶液近乎透明色。