活性氧（ROS）檢測試劑盒（紅色熒光）

貨號：O041

存儲條件：-20℃避光保存。有效期 1 年。

產品組分：

產品描述：

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)包括超氧自由基、*、及其下游產物過氧化物和羥化物等，參與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。活性氧檢測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一種利用熒光探針進行活性氧檢測的試劑盒。二氫乙錠 DHE(Dihydroethidium)，可自由透過活細胞膜進入細胞內，并被細胞內的 ROS 氧化，形成氧化乙錠；氧化乙錠可摻入染色體 DNA 中，產生紅色熒光。根據(jù)活細胞中紅色熒光的產生，可以判斷細胞ROS 含量的多少和變化。DHE 在細胞內主要被超氧陰離子型 ROS 氧化，用流式細胞儀或熒光顯微鏡可直接觀察。

二氫乙錠本身為藍色熒光，最大激發(fā)波長為 370 nm，最大發(fā)射波長為 420 nm，脫氫后與 RNA或 DNA 結合產生紅色熒光，最大激發(fā)波長為 488～535nm（最適激發(fā)波長是 518nm），最大發(fā)射波長為 610 nm。

本試劑盒只可以用于細胞的活性氧檢測，本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。

自備器材：

激光共聚焦顯微鏡或熒光分光光度計或熒光酶標儀激發(fā)波長 488～535nm，發(fā)射波長 610nm。離心機，移液器，PBS/ HBSS/ HEPES 緩沖液（不含酚紅和鈣鎂）等相關儀器。

使用說明（僅供參考）：

貼壁細胞染色：

(1) 使用前用 PBS 或者無血清培養(yǎng)基稀釋母液至所需工作濃度，通常 5~20μM （按染色液：稀釋液的比例為 1:1000 到 1：250）就可以滿足實驗需求，具體的濃度要根據(jù)實驗需要進行進一步的調整。

(2) 以 96 孔板為例，細胞量在每孔 1x10^5-6時，加入的染色液量 200ul，工作液濃度在 5-20uM，室溫避光孵育 60min 或 37°C 孵育 30-40min。

(3) 去除染色液，用 1xPBS 浸洗 2 次后，顯微鏡檢測。

懸浮細胞染色

(1) 收集懸浮細胞，離心棄掉培養(yǎng)基，用 PBS/ HBSS/ HEPES 緩沖液（不含酚紅和鈣鎂）將細胞調整為 1x10^5-6/ml 的細胞懸液。

(2) 200μL 的細胞懸液里面加入 1-2μL 的紅色熒光染料原液（5mM），吹打混合均勻，室溫避光孵育 60min 或 37°C 孵育 30-40min。

(3) 孵育后，250-500g 離心 5min-10min，去除染色液，用 PBS 清洗 2 次，顯微鏡檢測。

陽性對照：

陽性對照 Rosup 可以按照 1：1000 的比例使用。例如裝載好探針的細胞共 1mL,可以加入 1μL的陽性對照刺激。通常刺激后 0.5-4h 內可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對于不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后 0.5h 內觀察不到活性氧的升高，可以適當提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可以適當降低活性氧陽性對照的濃度。

對于某些特別的細胞，實驗過程中如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以1:2500-1:1000 稀釋探針的終濃度為 2-5μM。探針裝載的時間也可以根據(jù)情況在 15-60 min 內適當進行調整。

注意事項

1. 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內的探針，否則會導致背景較高。

2. 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。

3. 有的細胞裝載探針后細胞容易漂起來，洗細胞時實驗組會吸走一部分細胞。所以種細胞時細胞量增加一倍，這樣細胞緊密連接，貼壁比較牢，實驗組的熒光值可能就會升高。另外有的細胞對探針很敏感，建議工作液濃度適當?shù)偷?/span> 1-2μM。濃度太高容易有非特異性染色。

4. 探針經稀釋后很不穩(wěn)定，一旦氧化，本底熒光值就會升高，工作液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

5. 染?液為 DMSO 溶液，氣溫較低時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要充分融解后使用，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

6. 結果處理，推薦表示細胞活性氧強度=熒光強度/蛋白（mg），并且結合相關文獻數(shù)據(jù)進行計算。

7. 如果是流式檢測，推薦貼壁細胞用yi酶消化制備成單細胞懸液；懸浮生長細胞，直接收集細胞。用 PBS 重懸細胞 1x10^5-6/ml。

8. 活性氧陽性對照(Rosup) 僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加?活性氧陽性對照。

9. 定量需要作標準曲線。先做一個推薦不同濃度 H2O2（100-400μM）氧化熒光值，做標準曲線，X 軸為 H2O2濃度，Y 軸是熒光值，得出一個方程，再判斷樣品的熒光值即 Y 值是多少，計算出對應的 X 值即可。

10. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。