熒光標記鬼筆環(huán)肽633(遠紅)

產(chǎn)品貨號：G0053  

Abs/Em (nm)：555/565

存儲溫度：-20℃干燥、避光保存，有效期見外包裝。若配制成水溶液，應(yīng)小量分裝保存。

注意事項

本產(chǎn)品為凍干粉形式，微量不易觀察，使用前請瞬時離心，加適當溶劑溶解后使用，溶解后的溶液近乎透明色。

產(chǎn)品簡介

鬼筆環(huán)肽是從致命的傘形毒蕈蘑菇中分離出來的一種毒素。 它是特異性結(jié)合于F-肌動蛋白的雙環(huán)肽。因此用熒光染料標記的鬼筆環(huán)肽可以非常方便的研究F-肌動蛋白的分布。鬼筆環(huán)肽內(nèi)部，在半guang氨酸和se氨酸之間含有不常見的硫醚橋形成內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。在pH升高時，該硫醚被裂解，鬼筆環(huán)肽失去對肌動蛋白的親和力。

熒光標記的鬼筆環(huán)肽可在納摩爾水平染色F-肌動蛋白。在各種植物細胞或動物細胞中，標記的鬼筆環(huán)肽對大、小細絲具有相似的親和力，平均每個肌動蛋白亞基結(jié)合一個鬼筆環(huán)肽分子。不同于抗體，鬼筆環(huán)肽與肌動蛋白的結(jié)合親和力在不同物種間沒有顯著變化。非特異性染色可以忽略不計，染色和未染色區(qū)域之間的對比度非常大。鬼筆環(huán)肽將單體/聚合物的平衡轉(zhuǎn)向聚合狀態(tài)，將聚合臨界濃度降低至30倍。Phallotoxins可通過抑制細胞松弛素的解聚， 碘化jia和升高的溫度，穩(wěn)定 F-肌動蛋白，。因為鬼筆環(huán)肽綴合物很小，大約直徑12-15埃，分子量<2000道爾頓，多種肌動蛋白結(jié)合蛋白，包括肌球蛋白，原肌球蛋白和后肌鈣蛋白依然可以和鬼筆環(huán)肽標記的肌動蛋白結(jié)合。更重要的是， 鬼筆環(huán)肽標記的肌動蛋白絲保持功能，標記甘油肌纖維仍然收縮，標記的肌動蛋白絲仍然可以繼續(xù)移動。而且熒光標記的鬼筆環(huán)肽也可用于對細胞中 F-肌動蛋白進行定量研究。

實驗方法

儲液制備

熒光染料標記的鬼筆環(huán)肽：取適量甲醇或無菌水溶解棕色管中凍干的粉末，制備成200 T/mL的儲液（300T規(guī)格染料加入1.5 mL的液體，50T規(guī)格染料加入0.25 mL的液體即可）。

熒光標記鬼筆環(huán)肽的一個單位（T）的定義是染色一個加載細胞的載玻片所用染料的量。 對于熒光標記的鬼筆環(huán)肽，使用時的推薦稀釋比例為1:40-1:200，一個單位相當于200 μL總?cè)旧w積中加入1-5 μL 200T/mL儲備溶液。

注：稀釋比例可以根據(jù)實際染色效果進行適當調(diào)整。

固定細胞染色

以下方案是針對生長在玻璃蓋玻片或8孔室玻片上的貼壁細胞的染色步驟。鬼筆環(huán)肽也可用于染色固定的冷凍或石蠟組織切片。

1. 用PBS清洗細胞3次。

2. 用含有3.75％甲醛的PBS溶液固定細胞，冰上固定15 min。

注意：甲醇可以在固定過程中破壞肌動蛋白。因此最好避免含有任何甲醇的固定劑。優(yōu)選的固定劑是不含甲醇的甲醛。

3. 用PBS清洗細胞3次。

4. 用含0.5％Triton X-100的PBS溶液在室溫下透化細胞10 min。

5. 用PBS清洗細胞3次。

6. 用200μL PBS稀釋1-5 μL熒光標記的鬼筆環(huán)肽儲液，加入一個蓋玻片或孔中，室溫孵育20min，進行染色。

注：染色體積可根據(jù)樣本情況進行調(diào)節(jié)。孵育過程中為避免染液揮發(fā)，可將蓋玻片放于密封容器內(nèi)。

7. 用PBS清洗細胞2-3次。

8. 熒光顯微鏡觀察。標記的鬼筆環(huán)肽具有很好的光穩(wěn)定，樣品可以在PBS中成像，但為了效果zui 佳，也可以使用抗熒光淬滅劑觀察。

活細胞染色

熒光標記的鬼筆環(huán)肽不具有細胞透性，因此沒有被廣泛用于活細胞標記。然而，有報道稱活細胞可能通過胞飲或未知機制進行標記。一般來說，染色活細胞時需要更多的染料。或者，熒光標記的鬼筆環(huán)肽也可被注入到細胞中用于監(jiān)測肌動蛋白分布和細胞運動。