內(nèi)切酶 SgrAI

產(chǎn)品組成

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

SgrAl 來(lái)源于灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)，經(jīng)大腸桿菌重組表達(dá)后純化獲得，特異性識(shí)別并切割CR/CCGGYG 序列。SgrAl 屬于非快切系列限制酶，但可兼容LabFD 緩沖液,可用于和其他 LabFD 系列限制酶進(jìn)行雙酶切。基于酶的特殊性SgrAI 需要兩個(gè)及以上的酶切位點(diǎn)才能實(shí)現(xiàn)高效切割，對(duì)單位點(diǎn)的底物切割效率顯著下降。

建議反應(yīng)條件：1×Cut buffer B；37℃溫育；參照“DNA 快速酶切流程"配制反應(yīng)體系。

失活條件：80℃溫育 20 min。

活性定義：1 活性單位 (U) 是指在 50 μl 反應(yīng)體系中，37℃ 1 h內(nèi)wan全酶切 1 µg λDNA 所需的酶量。

質(zhì)量控制

功能活性檢測(cè)

37℃下，在 20ul 反應(yīng)體系中，10U SgrAI 能夠在 15min 內(nèi)wan全消化1ug λDNA。

超長(zhǎng)時(shí)間溫育檢測(cè)

37℃下，將 10U SgrAI 與1ug λDNA 共同溫育 3h，未檢測(cè)到其他核酸酶污染或星號(hào)活性引起的底物非特異性降解，延時(shí)酶切可能出現(xiàn)星號(hào)活性。

酶切-連接-再酶切檢測(cè)

37℃下，使用 10 U SgrAI 消化 DNA 底物，回收酶切產(chǎn)物，在 22℃下使用 T4 DNA Ligase (Fast) 可以將酶切產(chǎn)物重新連接。將連接產(chǎn)物再次回收后，使用相同的內(nèi)切酶可以重新切開(kāi)連接產(chǎn)物。

使用方法

1.DNA 快速酶切流程

（1）在冰上按如下建議的加樣順序配制反應(yīng)體系：

a. DNA 底物中應(yīng)不含ben酚、氯仿、乙醇、EDTA、洗滌劑或高濃度鹽，否則將會(huì)影響SgrAI酶活性。

（2）輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時(shí)離心以收集掛壁液滴；

（3）37℃溫育 15min~60min；

（4）80℃溫育 20 min 即可使酶失活，或者通過(guò)吸附柱或ben fen/氯仿純化終止反應(yīng)。

2. 注意事項(xiàng)

①酶切需要兩個(gè)或兩個(gè)以上識(shí)別位點(diǎn)。

②每 μg DNA 底物使用的酶量不建議超過(guò) 10 U。

③因?yàn)榉磻?yīng)中酶的穩(wěn)定性，即使溫育時(shí)間超過(guò)1h也不會(huì)提高酶切效率，除非增加酶量。

④延長(zhǎng)酶切時(shí)間、高濃度酶或>5% 的甘油濃度可能產(chǎn)生星號(hào)活性,尤其不建議過(guò)夜酶切。

不同 DNA 中的酶切位點(diǎn)數(shù)量

甲基化修飾影響

在不同反應(yīng)緩沖液中的活性

注：活性數(shù)據(jù)來(lái)自 LABLEAD 限制酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下的檢測(cè)。